luciferase荧光素酶底物-luciferase

1、? 实验简介

Luciferase报告基因系统是以 荧光素(luciferin) 为底物来检测 萤火虫荧光素酶 (fireflyluciferase)活性的实验。荧光素底物会在荧光素酶作用下会发光（波长540-600nm），且光强能反应荧光素酶的表达量。荧光素酶的蛋白表达量与启动子活性、mRNA的稳定性及翻译效率相关。从而将待测启动子、UTR等序列与荧光素酶ORF框融合表达，再检测其发光强度，就能判断这些序列对蛋白表达的影响

为了减少实验误差，同时转染一个能稳定表达的 肾荧光素酶 的质粒作为内参，催化 腔肠素 氧化产生蓝光（波长460-540nm）；所以叫双荧光素酶报告基因检测。

2 . 实验流程图

3 . 服务内容：双荧光素酶报告检测启动子活性服务主要分为以下两种：

a . ? 启动子活性分析，用于检测待测启动子是否有活性及其活性区域；

b . ? 启动子与转录因子结合验证，用于研究某转录因子是否调控某基因的待测启动子，以及它们的结合区域

项目 服务内容 结果交付 实验周期 客户提供

启动子活性分析 合成和构建2kb启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告30工作日1、细胞

2、基因信息

构建截短启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告

细胞培养和双荧光素酶检测检测数据和实验报告

启动子与转录因子结合验证 合成和构建野生型启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告30工作日[if !supportLists]1、?[endif]细胞

[if !supportLists]2、?[endif]基因及转录因子信息

构建突变型启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告

构建转录因子表达载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告

细胞培养和双荧光素酶检测检测数据和实验报告

?

4. 送样要求

a.重组载体：

质粒不少于2ug，或甘油菌约100ul

b.细胞：

活细胞，2个T25瓶，细胞汇合度＞80%（广州市内）；或冻存细胞2管（广州外地区）

备注：载体或细胞可由如期代为构建或购买

?

5. 样本保存和运输要求：

a. 质粒或甘油菌可用冰袋保存运输；

b. 活细胞常温取样；

c. 冻存细胞干冰取样/运输：需要至少在送样前一天通知我方

双荧光素酶报告基因实验原理

1）转染效率。我想用原代细胞做。用invitrogen的lipofectamine 2000转染，35mm dish，用1-2微克质粒，3微升lipofectamine。我们实验室做其它基因转染时测的效率差不多5%-10%。不知道这样的转染效率够不够？我还需要在试验之前先检测转染效率吗？或者必须用其它方法增加转染效率？

答：5%-10%效率是比较低的，转染效率主要跟细胞种类有关系，患质粒一般没什么影响。如果lipofectamine都效率低下的话，尝试用电转吧。

2）转染比例。我已构建target promoter-luc载体，打算用b-gal作内参，但不知道他们之间常用的比例是多少？用35mm dish培养细胞，细胞数量大约10的5次方。我该选择哪几个比例，多少微克质粒做预试验？

答：按照protocol上提供的范围自己慢慢摸条件

3）转染时间。一般转染多长时间后作试验处理？24小时够吗？

答：如果我没记错，lipofectamine的转染时间是4－6h吧。至于转染完了多长时间检测，一般12－48小时，可以多做几个时间点

4）细胞裂解。裂解产物放在-70可以保存多长时间，luciferase活性不变？

答：放几天没问题，没必要放太久吧

5）检测比例。检测时，裂解产物与底物之间的比例如何确定？按照标准protocol就可以吗？

答：按照标准protocol。但裂解细胞时加入裂解液的量要根据你细胞的多少自己调整，如果细胞少，裂解液加少点

6）检测注意事项。检测时，室温一定要控制严格吗？pH值该怎么注意？

答：底物要在室温下处于最佳反应条件，因此最后检测的时候要在室温进行。之前的步骤为了防止蛋白降解，要在4度进行。pH值好像没什么关系吧，照protocol来就是了

什么是双荧光素酶

双荧光素酶报告基因实验原理具体如下：

双荧光素酶报告基因实验原理是利用双荧光素酶作为荧光素酶的标记来研究基因表达与调控的机制。双荧光素酶报告基因实验是一种基因表达定量分析技术，通过将双荧光素酶Luciferase作为报告基因插入到需要研究的靶基因启动子区域或转录后区域，使其与靶基因协同表达。

当荧光素基质（Luciferin）被添加时，双荧光素酶催化荧光素基质的氧化反应产生可检测的光信号，从而定量地测定报告基因的活性水平。首先需要将双荧光素酶编码序列克隆到适当的表达载体中，然后将其导入目标细胞中，使其与靶基因表达协同进行。

接着将荧光素基质添加到细胞中，通过检测产生的光信号来定量测定报告基因的表达水平。该技术具有高灵敏度、精准度高、重复性好、操作简便等优点，荧光素酶报告基因检测是以荧光素，可以用于研究基因表达调控机制、筛选药物和检测细胞信号通路等。

但也存在一些局限性，如需要对目标细胞进行转染处理、被测基因的上游或下游序列需要足够长等。双荧光素酶报告基因实验常被用于研究转录因子与DNA结合、靶基因的启动子区域、miRNA的调控作用、RNA剪接等生物过程，从而深入地了解基因调控的机制。

同时，该技术也可以用于鉴定抑制剂和激动剂、筛选小分子化合物、检测细胞信号通路等方面。双荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学技术，其原理简单易行，应用广泛。通过该技术可以揭示基因表达和调控的机制，在生物医学领域中具有重要的应用价值。

萤火虫荧光素酶（Luciferase）标记肿瘤细胞活体成像技术的方法介绍

荧光素酶（Luciferase）是催化莹光素氧合而发光的蛋白酶 即[让萤火虫尾部荧光素发出荧光的蛋白质 ]

莹光素 + ATP + O2 --> 氧合莹光素 + AMP + PPi + 荧光

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，许多大中型城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤亡率的首位。乳腺癌复发转移是导致乳腺癌患者亡的最主要原因，淋巴结阴性的患者中约有24%～30%出现复发转移，淋巴结阳性的患者中复发转移率高达50%～60%，而转移性乳腺癌的5年生存率仅为26%。

萤火虫荧光素酶（Luciferase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞.

一．细胞方法

将带有荧光素luc转酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-7，利用G418筛选，获得稳染人乳腺癌细胞株MCF-7-luc，并在稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆MCF-7体外评价其发光能力。通过建立裸鼠移植瘤模型，利用活体生物发光成像系统检测肿瘤生长及转移情况，为下一步监测裸鼠移植瘤对药物作用的变化情从而为分析药物对肿瘤的治疗效果提供理想的状况.

G418筛选浓度的确定：

37℃细胞培养箱中常培养,G418按0、200、400、600、800、1000μg/ml设置6个浓度梯度。在细胞接种24h后，加入6孔板中，每个浓度设2个孔在10～14d内全部亡。每天观察细胞生长情况，亡最低的G418浓度，即为筛选质粒转染克隆MCF－7细胞的浓度。

1)细胞转染

取对数生长期的MCF－7细胞，将细胞接种于6孔板内待细胞融合度达到80%～90%孔培养板中，TM即可转染。按照Lipofectamine2000试剂盒操作指南进行转染。在250μl无血清、无双抗的DMEM培培养基中加入luc质粒8μg/ml的pRc/CMV2-在250μl无血清、无双抗的DMEM培养基中加入10μlLipofectamineTM2000，室温培育5min。将上述2种稀释液混匀，室温培育30min后加入细胞孔板中，置于培养箱常规培养。

转染24h后胰酶消化细胞并按1∶6比例接种到新6孔板中，同时加入实验确定的浓度G418，随后每2d更换一次培养基并维持G418筛选直至单细胞抗性克隆的出现。分别挑选单一抗性克隆至96孔板，待其逐渐增殖后转入24孔板中继续传代培养。

3)荧光素酶活性鉴定阳性克隆

单一抗性克隆传代至第五代时用LuciferaseAs-sayAystem检测荧光素酶活性。检测时，各克隆按1×105个/孔接种到24孔板，24h后细胞裂解液裂解12000rpm，4℃离心10min，收集裂解物，取上清10μl加入96孔白板中，向每孔加入50μl荧光素酶96microplateluminometer连续读底物，停留2s后，取10s的荧光值（RLU），每个克隆设3个复孔，保留RLU值高的细胞克隆继续传代培养，再过5代后进行荧光素酶活性检测。保留RLU值维持较高的克隆直至第30代，荧光素酶活性最高的几个克隆MCF-7-luc即为阳性克隆.

各不同数量细胞克隆的荧光值检测7-luc阳性克隆细胞按细胞数将筛出的MCF-4×104、2×104、1×104、5000、2500、1250、625、312和156分别接种到96孔黑板中，另外一组仅有细胞，一组仅有培养基作对照，设置2个复孔，常规培去上清并用PBS洗两次，每孔加入100μl养24h后，Luciferin使其终浓度为150μg/ml，PBS，再加入D-立即用活体成像系统检测，分析发光强度与细胞数之间的相关性。

4)细胞生长曲线绘制

MCF7-luc细胞和作为对照取表达荧光素酶的MCF-7细胞，接种于24孔板，接种密度为2×104/孔。细胞接种后1～7d，每天胰蛋白酶消化其中3孔细胞，用细胞计数仪测定细胞数。以细胞生长天数为横坐标，细胞数目为纵坐标，分别绘制两种细胞生长曲线。

二．动物模型

BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立BLAB/cnu/nu裸鼠，4～5周龄，体重（15±2）g，雌雄各3只。取对数生长期的MCF-7用PBS重悬为2．5×10/ml悬液，每只裸鼠左右背侧近腋部皮下接种100μl，共接种6只。接种后第5d采用德国BERTHOLD公司的活体成像系统检测信号强度。以后每5d观测一连续观测30d。观测前每只裸鼠戊巴比妥钠麻醉（计量为：35mg/kg体重），按150mg/kg体重的量腹腔注射luciferin（invivograde），10min后，进行活体成像观察皮下肿瘤的生长情况，定量分析各时间点的荧光值。绘制肿瘤皮下生长曲线.

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下移植瘤的病理形态学观察

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下接种后25d，脱颈处小鼠，取肿瘤组织，制成石蜡切片，切片厚度为3μm，经HE染色后观察细胞的病理形态学。

活体动物成像技术是近期发展起来的一种新型稳定可靠,是检测动物体内分子及细胞事件的影像检测技术，强有力手段。利用生物发光成像（BLI）可以对活体病灶的大小进行无损伤直观准确检测。

我们有自己的独立有机合成实验室，可以生产合成各种化学发光试剂，我们可以提供化学发光试剂、化学发光底物、发光标记物、发光增强剂、染料探针类、微生物和酶的显色底物以及体外诊断试剂。

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